АТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ КРИСТАЛЛОВ ЛИЗОЦИМА
Как известно, большинство закономерностей роста для неорганических и органических кристаллов одинаковы. Для исследования процессов кристаллизации методом АСМ удобнее выбирать высокомолекулярные кристаллы. Поскольку размеры строительных единиц у большинства неорганических кристаллов составляют доли нанометра, а размеры молекул белковых кристаллов на порядок больше, то именно белковые кристаллы могут служить хорошей модельной системой для изучения роста кристаллов.
Рассмотрим принцип работы и устройство АСМ на примере микроскопа марки NanoScope III, производства Digital Instruments® (USA).
В основе метода атомно-силовой микроскопии лежит регистрация изменения взаимодействия между атомами на острие зонда и атомами, формирующими поверхность образца.
схема АСМ
Для перемещения образца в 3-х взаимно перпендикулярных направлениях X, Y и Z используется сканер, который представляет собой пьезоэлектрический транслятор. Детектирующая система включает в себя лазер, генерирующий пятно света на левере, и фотодетектор, состоящий из 4 светодиодов. Схема представлена на рис. 5. Лазерный луч, отраженный от левера, попадает на зеркало, а затем на фотодиоды. Там, в зависимости от положения лазерного пятна, генерируется выходное напряжение, служащее для управления положением образца и фиксации взаимодействия иглы с образцом.
В положении "контакта" атомно-силовой микроскоп может отображать информацию в 3 режимах:
1. постоянной высоты
2. отклонения
3. трения
Режим "постоянной высоты" отображает изменение положения пьезосканера в направлении Z, необходимое для поддержания постоянным отклонение левера. В этом режиме разностный сигнал верхних и нижних сегментов фотодиода поддерживается на постоянном уровне. Режим "отклонения" отображает изменение разностного сигнала верхнего и нижнего сегментов фотодиода, т. е. сигнал ошибки цепи обратной связи.
В режиме "трения" измеряется разностный сигнал правых и левых сегментов фотодиода, отображающий величину сил трения, действующих на зонд при сканировании.
 |
 |
| АСМ NanoScope III | жидкостная кювета |
Для наблюдения процесса кристаллизации используется экспериментальная установка состоящая из атомно-силового микроскопа марки NanoScope III, производства Digital Instruments® (USA), специальной жидкостной кюветы , позволяющей наблюдать поверхность растущего в растворе кристалла и системы подачи и термостатирования раствора. Кювета представляет собой стеклянную камеру с отверстиями для протока раствора и термодатчика. Внутри кюветы закрепляется левер.
Подложка с исследуемыми образцами, установленная на сканере, герметично накрывается сверху кюветой. После чего в кювету подается раствор. Кристаллы для дальнейшего наблюдения выбираются с помощью видеокамеры с 750-кратным увеличением, расположенной над образцом и подключенной к телевизору.
В процессе сканирования зонд движется относительно образца строка за строкой над определённым участком поверхности. Время записи рельефа участка поверхности с разрешением 512x512 точек зависит от скорости сканирования и составляет 512/H секунд при частоте сканирования в H Гц.
При исследование ромбической модификации лизоцима обнаружен выход дефекта упаковки на растущей грани (010), он представляет собой незарастающую ступень, параллельную [100]. В процессе роста ступени приходится огибать дефект, так как он препятствует нормальному движению ступени. Справа от дефекта ступень развивается беспрепятственно (также как и в областях отсутствия дефекта). Слева, в направлении оси а, рост начинается только с того момента, когда длина ступени достигает критического значения lкр. По серии последовательно снятых подобных кадров возможно измерить зависимости длин, пройденных различными участками ступени от времени.
 |
 |
| Ромбическая модификация. (изображение получено при помощи видеокамеры) |
Дефект упаковки на грани (010) ромбического кристалла. |
Исследуя грань (101) кристаллов лизоцима моноклинной модификации, было установлено, что поверхность кристаллов растет по слоисто-спиральному механизму путем тангенциального движения элементарных ростовых слоев. Закрученный в спираль ростовой слой (дислокационный холм) формируется на поверхности кристалла дислокационными источниками различных типов. На рисунке представлен холмик роста, сформированный одной винтовой дислокацией.
 |
 |
| Моноклинная модификация. (изображение получено при помощи видеокамеры) |
Формирование дислокационной спирали на грани (101) моноклинного кристалла. |
На изображении структуры поверхности кристалла грани (101) при высоком разрешении, удалось визуализировать отдельные элементарные ячейки на поверхности кристалла. По данным рентгеноструктурного анализа параметры элементарной ячейки моноклинного кристалла: a = 2,8 нм, b = 6,25 нм, c = 6,09 нм (Rao et al [1996]).
На рисунке представлено АСМ-изображение участка поверхности, и его фрагмент, обработанный с помощью Фурье-анализа, позволяющего отсечь шумы и добиться четкости изображения. Обработка полученных данных осуществляется при помощи специализированного программного пакета "Фемтоскан-001" (Москва, Центр перспективных технологий). Данное изображение позволяет напрямую производить измерение характерных параметров кристаллической решетки. Расстояние между рядами ячеек на плоскости (101) равно 6,7±0,5 нм, что близко к рентгеновским данным: (a2+c2)1/2 = 6,7 нм.
 |
 |
| АСМ-изображение поверхности | фрагмент изображения, обработанный с помощью Фурье-анализа |
При помощи методов атомно-силовой микроскопии удается исследовать механизмы кристаллизации различных модификаций лизоцима и установить, что рост осуществляется по дислокационному механизму.
Этот метод позволяет получить изображение поверхности с молекулярным разрешением, по которому удается определить параметры элементарной ячейки кристалла, оценить скорости движения ступеней по поверхности кристалла, а также определить, что ступени перемещаются путем образования одномерных зародышей. На ступенях элементарной высоты можно наблюдать изломы, размер которых соответствует размеру 4-х молекул лизоцима.
Москва, 2003 год.